همسانه‌سازی و بیان آنزیم نوترکیب زایلاناز (xynA) در باکتری E. coli

Abstract

هدف: امروزه، افزایش جهانی قیمت ذرت در جیره طیور سبب جایگزینی گندم به جای ذرت شده است. اما وجود پلی‌ساکاریدهای غیرنشاسته‌ای در دیواره سلولی مانع جذب ترکیبات غذایی موجود در گندم توسط طیور می‌گردند. یکی از روش‌های حذف پلی‌ساکاریدهای غیرنشاسته‌ای موجود در گندم استفاده از آنزیم زایلاناز در جیره‌ی غذای طیور می‌باشد. زایلانازها سبب شکسته شدن پیوند اندو بتا (4-1) آرابینوزایلان در دیواره سلولی گندم می‌شود. هدف از این پژوهش تولید آنزیم نوترکیب مقاوم به حرارت زایلاناز در باکتری E. coli، به عنوان مکمل جیره غذایی طیور می‌باشد. مواد و روش‌ها: در این پژوهش ژن مقاوم به حرارت زایلاناز (xynA) در یک سیستم بیان ترشحی باکتریایی شامل: توالی‌ شاین-دالگارنو، سیگنال‌پپتید ترشحی Usp45 و پروموتر T7 در پلاسمیدpET-22b (+) از باکتریE. coli سویه BL21 (DE3) با استفاده از روش شوک حرارتی کلون شد. جهت القای بیان ژن نوترکیب زایلاناز از القاگر IPTG در زمان‌های‌ مختلف استفاده گردید. همچنین، بررسی شاخص‌های کاتالیتیکی نیز طبق روش DNS صورت پذیرفت. یافته‌ها: نتایج حاصل از کلونی PCR وجود توالی ژن نوترکیب زایلاناز به طول bp 743 را بر روی ژل آگارز 1 درصد تأیید نمود. ژل اکریل‌آمید SDS-PAGE، حضور پروتئین با وزن مولکولی kDa 27 را نشان داد. همچنین میزان فعالیت پروتئین نوترکیب به مقدار 47/189 (unit/ml) با استفاده از روش DNS در دمای بهینه °C65 و 6 pH= تعیین گردید. علاوه بر این، نتایج منحنی میکائیلیس-منتن میزان ثابت میکائیلیس (Km) و حداکثر سرعت واکنش (Vmax) را برای آنزیم نوترکیب زایلاناز به ترتیب 1/4 (mg/ml) و 87 (unit/ml) تعیین نمود. نتیجه‌گیری: زایلانازها مهمترین آنزیم‌های مکمل جیره طیور می‌باشند که در جیره‌های بر پایه گندم اضافه می‌شوند. نتایج نشان داد، آنزیم نوترکیب حاصل، دارای فعالیت و غلظت مناسب می‌باشد و مقاوم به حرارت است. همچنین آنزیم نوترکیب زایلاناز به دلیل خاصیت ترشحی بودن با هزینه اندک قابل استحصال می‌باشد.